Vitamin B12 Assay Medium

사용처
Vitamin B12 Assay Medium은 세균 분석 기술을 이용하여 비타민 B12 농도를 결정하는데 사용된다.

요약 및 설명

  Vitamin B12 Assay Medium은 Capp, Hobbs와 Fox에 의해 기술된 조성에 따라 만들어졌다. 본 배지는 Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis ATCC 4797 또는 7830을 사용하여, 비타민 B12에 대한 세균학적 분석에 사용된다.

시험원리
  Vitamin B12 Assay Medium은 L. delbrueckii subsp. lactis ATCC 4797 또는 7830의 배양을 위해 필수적인 모든 다른 영양소와 비타민을 포함하고 있는 vitamin B12-free medium이다. Standard curve를 얻기 위해, USP Cyanocobalamin Reference는 적정법 적인(titrimetricall)y 또는 탁도계(turbidimetrically)적으로 측정되는 성장 반응을 제공하면서, 특정적으로 증가되는 농도를 추가하였다.

주의
  미생물학 분석 과정에서 배지나 유리기구의 오염을 피하기 위해 매우 조심해야 한다. 아주 작은 량의 외부 물질도 잘못된 결과를 제공하기에 충분할 수 있다. 세제 또는 다른 화학 물질이 묻지 않은 깨끗한 유리기구가 반드시 사용되어야 한다. 유리기구는 존재할 수있는 유기 잔여물을 태워버리기 위해서 반드시 250℃ 에서 최소한 한시간 이상 가열하어야 한다.

분말제품으로부터 배지 만드는 방법
 1. 증류수 100mL에 7.6g의 분말을 혼합한 후 섞는다.
 2. 수시로 저어주면서 가열하고, 2-3분간 끓인다.
 3. 5mL를 튜브에 넣고 균일하게 침전물을 풀어준다.
 4. standard 또는 시험 샘플을 첨가한다.
 5. 튜브의 양을 10mL로 조정한다.
 6. 121℃, 5분간 고압증기멸균 한다.   

시험절차
  시험 균, L. delbrueckii subsp. lactis ATCC 4797 또는 7830,의 보존용 배양물은 Lactobacili Agar AOAC 또는 B12 Culture Agar의 stab inoculation로 준비된다. 24-48시간 동안 37℃에서 배양한 후, 냉장고에 튜브들은 보관한다. 계대는 2주의 간격을 두고 이루어 진다. 분석을 위한 접종물은 Lactobacilli Broth AOAC 또는 B12 Inoculum Broth 10mL가 들어간 시험관 안에 L. delbrueckii subsp. lactis ATCC 4797 또는 7830의 stock을 2차 배양해서 준비한다. 35-37℃에서 18-24시간 동안 배양한 후, 균들은 무균상태에서 원심분리되고, 상층액을 가만히 따라 버린다. 균들을 살균된 0.85% 생리식염수 10mL에서 다시 현탁시켜서 세척한다. 세척은 총 3번 반복된다. 최종적으로 살균된 0.85% 생리식염수 10mL에 균을 재부유한다. 그런 다음 균 현탁액을 살균된 0.85% 생리식염수를 사용해서 1:100 비율로 희석한다.각 분석용 시험관에 접종하기 위해  1방울을 사용한다.

  매 분석이 실행될 때마다, 필수적으로 표준곡선이 구성한다. 표준곡선 판독에 영향을 미치는 고압증기멸균의 상태와 배양 온도는 항상 중복 될 수 없다.

  표준곡선의 준비에 요구되는 농도는 충분한 25% 에탄올을 USP Cyanocobalamin(B12) Reference 기준의 정확한 양에 추가함으로써 얻어진다(결과적으로 mL당 1.0μg의 cyanocobalamin이 들어간 용액이 만들어진다). 이 stock solution은 냉장고에 보관되어야 하며, 또한 반드시 60일 이내에 사용되어야 한다. 표준곡선의 준비에서, 이 stock solution(1μg/mL)의 추가적인 희석물은 다음과 같이 만들어 진다:

A. sotck solution 1mL를 99mL의 증류수에 넣는다. (1mL = 10ng)
B. A의 용액 1mL를 199mL의 증류수에 넣는다. (1mL = 0.5ng)

  분석용 시험관 당 0.0, 0.025, 0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25ng 레벨의 USP Cyanocobalamin(B12) Reference 기준을 사용함으로써, 용인할 수 있는 표준곡선이 얻어진다. 이것은 분석용 시험관 당 0.05ng/mL 용액 0, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5mL와 시험관 당 10mL 를 만들기 위한 충분한 증류수를 추가함으로 완성할 수 있다.

  배양 이후, 표준 농도는 1.25mg의 dry cell weight와 같은, 5mL 레벨 이상에서 투과율 값을 제공하는데 사용된다 (광도계의 calibration 방법과 dry cell weight 결정 방법에 대한 USP 참조). 또한 배양 이후 적정법(titrimetric) 방법에서, 표준농도는 8-12mL 0.1N soldium hydroxide의 5mL 레벨에서 적정값(titration)을 제공하는데 사용되어야만 한다.

  접종하고 35-37℃에서 18-24시간 동안 배양한다. 탁도 결정을 위해서는, 성장을 멈추게 하기 위해 시험관을 2-8℃의 냉장고에 15-20분간 넣어 놓는다. 성장은 nephelometric 방법에 의해 측정된다. 성장의 적정 결정은 37℃에서 72시간 동안 배양된 후 이루어지며, 이후 획득된 수치로부터 곡선은 생성된다.

예상결과
 1. 각각의 시험관, 디스크, 컵 안의 기준양에 따라 반응 판독을 표시함으로써 표준 농도 반응을 만든다.
 2. 표준곡선으로부터 보간법(interpolation)을 사용해서 분석 용액의 각 레벨에서 비타민 양을 결정한다.
 3. 이들 양의 평균치로부터 샘플에 있는 비타민 농도를 계산한다. 오직 평균에서 10% 이내의 수치들만을 사용한다. 또한 수치들의 2/3가 10%이내를 넘지 않을 때만 그 결과들을 사용한다.

제한 요소
 1. 분석용 배지에 접종하는데 사용된 시험 균은 반드시 이 목적에 추천되는 배지에서 배양되고 유지되어야 한다.
 2. 전체 분석 과정에 걸쳐서 무균 기술이 사용되어야 한다.
 3. 변형되거나 결함이 있는 배지를 사용하는 것은 만족스러운 반응을 제공하지 않을 다른 영양 요구성을 갖는 돌연변이를 초래 할 수 있다.
 4. 이러한 절차의 성공적인 결과를 위해서는, 분석의 모든 조건은 정확하게 준수되어야 한다.